【本篇報導由化學系  葉怡均教授研究團隊提供】

　　在當今生物科技的迅速發展中，全細胞生物傳感器因其在檢測目標分子方面的潛力而受到廣泛關注。然而，這些傳感器的選擇性和精確性仍然受到自然中蛋白質對其受質具有廣泛耐受性的限制而無法有絕對專一的偵測。為了解決這一問題，研究團隊提出了一種創新方法，通過整合邏輯閘門系統來增強全細胞生物傳感器的性能。本研究主要集中在來自假單胞菌的HrpR/S蛋白調控系統，這是一個在合成生物學中廣泛使用的異源調控模組。通過在大腸桿菌中構建一個正交邏輯閘門，比較了HrpR/S系統與自我組合的分裂螢光蛋白，並使用Spy Tag/Spy Catcher系統進行融合。研究的目標是在同時存在IPTG和Hg(II)離子的情況下選擇性地啟動報告基因。共同的特性都是需要具有兩個訊號同時啟動才有最後得以偵測的信號。這一研究不僅推進了合成生物學的應用，也為未來的生物傳感器設計提供了重要的理論基礎。

　　邏輯閘是數位電路的基本構件，透過對一個或多個輸入信號進行邏輯運算來產生輸出信號。這些輸入信號以二進位形式表示，為0或1，輸出信號也同樣是二進位。在分子計算領域，分子邏輯閘利用特定分子物種之間的化學反應並基於布爾邏輯原則處理信息。輸入和輸出信號由特定分子物種的存在或缺失表示，邏輯運算則是由輸入分子之間的化學反應完成。分子邏輯閘具有並行處理、可擴展性和生物相容性等優勢，使其適用於水質檢測、重金屬檢測、醫學診斷和環境監測等多種應用。 

　　在生物傳感器應用中，邏輯閘的概念被用來提高生物傳感器響應的可靠性、特異性和準確性。通過將邏輯運算整合進生物傳感器信號中，可以增強生物傳感器的整體性能。研究人員越來越多地將蛋白質、DNA和整個細胞等生物材料與AND閘結合，用於水質檢測、重金屬檢測、疾病診斷以及螢光、比色或螢光素酶檢測的信號輸出。在各類生物傳感器中，整個細胞生物傳感器的應用越來越受到重視。這些傳感器利用活細胞作為感測元件，這些細胞經過工程改造，能夠對特定目標分子產生特定的輸出。這些輸出可以是螢光變化、顏色變化或其他物理性質，然後由檢測器進行測量。整個細胞生物傳感器相較於其他類型的生物傳感器，具有更自然和靈敏的反應，能夠對目標分子進行複雜的處理和分析。此外，整個細胞生物傳感器可在高溫或高壓等惡劣環境中運作，這對其他類型的生物傳感器來說通常是挑戰。然而，整個細胞生物傳感器的設計和工程仍然相當複雜，且由於生物分子的自然受質耐受性，選擇性有限一直是個挑戰。 

　　本研究系統地評估不同的正交邏輯閘門組件，以提高整個細胞生物傳感器的精確度和特異性。研究中的一個組件是HrpR/S系統，該系統在合成生物學中被廣泛應用於創建AND閘系統。HrpR/S系統由兩種蛋白質組成，分別為HrpR和HrpS，其中HrpS具有轉錄活化的功能，結合到T3SS基因的啟動子區域，而HrpR則作為輔助劑且增強HrpS的活性。通過將HrpR/S系統與兩個不同的輸入信號整合，只有當兩個輸入信號同時存在時，報告基因才會表達。

　　在本研究中，研究團隊也探討自我組合的分裂螢光蛋白與Spy Tag/Spy Catcher系統結合的潛力，作為創建AND閘配置的整個細胞生物傳感器的替代方案。自我組合的分裂螢光蛋白具有自發組裝成功能性蛋白的獨特能力，並已在蛋白標記、支架和蛋白質-蛋白質相互作用研究中得到了廣泛應用。然而，它們在整個細胞生物傳感器中的AND閘配置的潛在應用仍然很大程度上未被探討。為了探索這一潛力，研究團隊正在研究Spy Tag/Spy Catcher輔助的螢光互補系統。而在本研究中，比較HrpR/S系統與自我組合的分裂螢光蛋白，目的是在兩個不同的輸入信號同時存在時選擇性表達報告基因。本研究重點是系統性地優化基因工程和AND閘整個細胞生物傳感器在各種工作條件下的性能，最終目標是確保它們在實際應用中的可行性。

　　總之，本研究強調了利用自我組合的分裂螢光蛋白和Spy Tag/Spy Catcher的融合來通過模組化蛋白邏輯工程化整個細胞生物傳感器，以提高其特異性。通過將這些蛋白質作為AND閘的構件，本研究使用的方法相較於HrpR/S邏輯系統具有簡化組件工程和降低基礎活性的明顯優勢。結果顯示，自我組合的分裂螢光蛋白在開發高性能生物傳感器方面的有效性，重金屬特異性測試突顯了它們對所設計系統的選擇性。此外，這些研究結果為克服整個細胞生物傳感器所面臨的受質耐受性挑戰，提供了一種系統性和可調整的方法。通過策略性地結合基因元件，研究人員得以構建能夠執行複雜計算任務並對特定輸入做出反應的基因電路。對新型構件和基因調控系統的探索，擴展了我們對生物調控的理解，推動了合成生物學應用的進步。

原文出處：Lin, P. H., Tsai, S. T., Chang, Y. C., Chou, Y. J., & Yeh, Y. C. (2023). Harnessing split fluorescent proteins in modular protein logic for advanced whole-cell detection. Analytica Chimica Acta, 1275. https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.341593